胶体金免疫层析技术

胶体金颗粒示意图
免疫胶体金技术就是免疫金标记技术,自1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学后,免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因具有简单、快速、准确和无污染等优点,在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。
目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法,。

1，免疫胶体金技术的基本原理

胶体金是利用氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合,因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。

医疗设备展Medtec China 2022注意到免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子高密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点。因而被用于定性或半定量的快速免疫检测中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

2. 胶体金的制备常用方法

胶体的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。2.1柠檬酸三钠还原法制备金溶胶取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液0.7mL,金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色,继续煮沸15min,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm,Alcm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关,一旦颗粒大小发生变化,光散射也随之发生变异,产生肉眼可见的显著的颜色变化,这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。

想要了解更多胶体金法及干化学酶法试剂卡的快速自动化生产及视觉检测技术的要点，来医疗设备展Medtec China2022同期：创新技术论坛和法规峰会2022技术论坛N：第四届医疗器械高端自动化制造技术论坛中，来自米克朗、烽禾升、卡勒、迪嘉、儒拉玛特、艾利特、中国船舶集团有限公司第七一一研究所等企业和研究所的嘉宾将在现场讲解医疗器械自动化前沿议题，点击快速预登记。

金溶胶颗粒的直径与制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同粒径的金溶胶,也就是不同颜色的金溶胶。

3. 胶体金形成过程介绍图：

大体来说，就是还原剂提供给溶液中带正电荷的金离子而产生金原子：
氯金酸+还原剂=胶体金HAuCl4+e-=Au0。

3. 层析法检测试剂目前市场上见到的典型的层析法检测试剂的组成成份可分为三个部分，其一是多孔材料，包括样品垫、吸水垫、结合垫及硝酸纤维膜;其二是试剂，如抗体、金标结合物等;其三是层压结构及卡盒，如PVC板、双面胶、盒等。层析法检测试剂的各组分，并非简单的相互叠加，改变其中的任一组分，都可能引起产品整体性能的变化。以最常见的早早孕检测试剂为例，影响其产品敏感度的因素可能有:*硝酸纤维膜的特性，主要反应在其流速上。*胶体金颗粒的大小，浓度等*结合垫的性能，金标结合物的量*样品垫的特性*检测线的位置及宽度*硝酸纤维膜和结合垫的叠压强度*捕获抗体的亲合力*检测线包被捕获抗体的量*结合抗体的特性

烧制胶体金的步骤

（一）操作：烧万分之一金，40-50nm左右。
1.用18.2兆欧水将氯金酸配制成1%的溶液，可以分装保存。再取1%的溶液1ml置于干净的烧杯或锥形瓶中，加水稀释成100ml（即0.01%，俗称万分之一金）。

2.在容器液面处做好标记，磁力搅拌器加热并快速搅拌，待初沸，一次性快速加入1%的柠檬酸三钠溶液1ml（加液的工具比如枪头、注射器等要清洁），持续搅拌。

3.接下来就是等，可以观察到明显的颜色变化，黄（氯金酸颜色）→灰黑（浑浊）→红（透亮），大概的趋势是这样的。变透亮的红色后可以停止加热，适当低速搅拌几分钟，冷却。

4.冷却后，补水至标记处，避光待用。无需过滤，常温和冷藏存放均可，不可冷冻。

（二）讨论：
1.原料：氯金酸，也叫氯化金、四氯金酸，一般含有结晶水，分子式HAuCl4或者AuCl3·HCl·XH2O。氯金酸对金属有腐蚀性，所以要用塑料药匙，他特别吸潮，所以直接用容器称量而不要用称量纸。为避免吸潮的影响，最好将整支氯金酸直接配制成1%的水溶液，再分装避光保存，可以-20℃避光冻存，纯化学物质，冻存主要是防止污染和长菌。

2.配1%的溶液步骤：这里是常用的质量百分比说法，1%氯金酸溶液就是1g氯金酸固体+99ml水。不用管氯金酸的厂家、纯度、结晶水数量、金含量等，就是氯金酸直接称重。但是需要注意的是，因为有上述差异的存在，不同厂家的氯金酸，在相同配比下，烧出来的金子粒径大小会有差异。

3.水：盐离子对胶体金稳定性有破坏作用，因此最好用18.2兆欧水（电子行业所称的超纯水），没有这种制水设备的话用三蒸水，实在不行的话，据说也可以用娃哈哈纯净水。

4.器皿：因为胶体金有洁癖，所以器皿需要彻底清洁（可以泡铬酸）。早期的论坛帖子都说为了防止玻璃器皿吸附胶体金，要硅化处理，硅化试剂有毒，咱们只是烧胶体金，又不是炼黄金，没必要把小命搭上，如果怕胶体金吸附在玻璃器皿壁上，可以先小量烧一点胶体金，然后固定容器烧金，相当于用胶体金代替硅化来封闭器皿表面。

5.加热工具：制备胶体金，温度在95℃以上即可反应，一般控制在100℃左右，过高的温度可能导致加热接触点的胶体金脱水死金，最终会在胶体金溶液表面漂一层油状物。常用的加热磁力搅拌器、加热套、电炉、微波炉等。出于控温的考虑和搅拌的要求，少量研发推荐用加热磁力搅拌器。

6.加液顺序：有上述加完氯金酸后加热，待沸腾后再加柠檬酸三钠的；也有先煮水，沸腾后再加氯金酸，之后再加柠檬酸三钠的；还有先加柠檬酸三钠再加氯金酸的，感兴趣的可以都尝试一下。不管哪一种加液顺序，都要求迅速加入、迅速混匀。

7.搅拌和控温：理论上，初始反应时，需要液体中试剂充分分散均匀、且各点反应温度相同、且同时发生反应，这样所有的晶核将在瞬间同时形成，最终形成的胶体金颗粒将具有同样的粒径。说起来容易做起来难，但这至少指明搅拌和控温在胶体金制备中有很重要的影响，尤其在大量煮金的时候，液柱高度、沸腾程度、加液时机、加液顺序和方式、反应温度、搅拌速度等等都需要研究优化。

8.补水：加热沸腾必然会流失一部分水，我们可以采用上面的做标记最后补水的措施，也可以在瓶口盖块玻璃片防止水蒸发流失。

9.胶体金的粒径与颜色：一般文献中都会出现如下一张表，虽然不一定准确，但也提供了一些信息。

首先，胶体金粒径和还原剂的加入比例有一定的关系，还原剂越多，胶体金粒径越小。

其次，不同粒径的胶体金最大吸收峰不一样，其颜色也不一样。有人会好奇为什么不同粒径胶体金颜色不一样？胶体金显示的颜色，是其吸收光的互补光颜色，说起来比较拗口，其实这是一个物理问题。

如光谱图所示，不同波长的可见光颜色不一样，我们熟悉的日光，包含全部这些可见光以及不可见的红外和紫外光。也就是这些有色光混合之后可以变成无色的白光。某一种颜色光和另一种颜色光混合之后变成白光，这两种光就是互补光色。如下图：
平时肉眼看物体之所以显示颜色，是因为日光（白光）照射之后，有的被吸收了，有的被反射回来了，我们看到的是反射光颜色，也就是吸收光的互补光颜色。

回过头来，我们再看一下常见的胶体金分光光度计扫描图，不同粒径的胶体金，虽然都是由金原子组成，但是不同粒径的原子排列是不同的，因此其对白光有不同的吸收表现，比如小粒径的金，其主要吸收500nm左右的蓝绿光，就会显示出互补的红色，而粒径增大之后，吸收峰红移，吸收540nm左右的绿光，就会显示出互补的紫红色。

烧制胶体金的原理

1.反应原理：氯金酸被柠檬酸三钠还原成胶体金颗粒，其过程为金离子（并非全部）→还原成金原子→迅速形成20面体的晶核→其他金原子吸附到晶核上→生长成椭球形的带负电的金颗粒（双电层结构，胶体金表面吸附着负电的AuCl2-离子，相对的H+则分散于胶体之间的溶液中）。

氯金酸一定时，还原剂越多，晶核数量越多，最终的颗粒体积越小，通过控制二者比例，我们可以制备不同大小的胶体金颗粒。常用的40nm左右的金，发红色，一般是1:1的关系，由于不同厂家原料也有影响，如果你感觉烧出来的偏紫，又很想要红色，下次烧金就再稍微增加点还原剂即可。试剂比例—-金子大小—-最大吸收峰—-颜色，这四者的对应关系各种文献说法不一，我们也没必要太纠结，金子大小与最终的产品性能有一定的关系，所以重要的是实验之初你要从试剂盒反应原理上确定是要大金子还是小金子，而不用去纠结40nm还是50nm，酒红色还是红色，最大吸收峰位置是525还是530。

烧金最重要的是一致性，不要这次烧出来粉红的，下次相同条件烧出来紫的就行了。而这个很考验细节，理论上，发生反应并且形成晶核的均一性，决定了最终胶体金颗粒的均一性，不幸的是，这个过程太快了，很难控制，发生的一瞬间结果就已经注定了。就像生孩子一样，你再怎么想要闺女，最后生出来也可能是个儿子，而你只能安慰自己生男生女都一样，然后默默的努力挣钱给儿子存老婆本。

2.金颗粒大小：常用20、40、60nm的胶体金颗粒（粒径大小）；另外，有些人喜欢用λ525、530表示，这个是指胶体金最大吸收峰位置，与颗粒大小有一丢丢关系，后面还会说到。如何选择不同粒径的金，有几个原则：颗粒越小，颜色越偏粉红，显色相对越弱，特异性相对越好；相反颗粒越大，颜色越偏紫，显色越强，特异性相对越差。

3.金浓度：万分之一、万分之二、万分之四等等，指烧金时溶液中氯金酸的浓度。由于反应非常迅速，浓度越高，金子质量越不容易控制，标记时的表现也是这样，高浓度金容易标死。但是在一定条件下，高浓度标记的效率会高，同时标记聚集意味着灵敏度会高（前提是抗体比较抗造，特异性非常好），所以相对来说，高浓度标记相对会节省一点原料。

4.胶体的稳定性问题：胶体金本身是疏水胶体，会因疏水作用力结合而聚集（随着聚集的程度加重，颜色由红→紫→蓝→黑），但因颗粒外层负离子的静电斥力而稳定悬浮于水中，加入NaCl等盐离子会破坏负电斥力（其实调节PH加碳酸钾也有这种影响），导致胶体金颗粒通过疏水作用力结合而死金，而我们标记后的胶体金因为结合了蛋白和合适的封闭，变成了亲水的胶体，减少了疏水位点，所以正常来说金标物更稳定，更耐受环境的破坏，这也是优化标记条件时NaCl滴定法的理论基础，但理论是个好理论，只是NaCl滴定法不正经，不推荐使用，后面标记的章节会再次介绍。

关于稳定性问题，也有说是盐破坏了胶体金的水化膜导致聚集，但是亲水胶体才主要由水化膜起稳定作用，比如蛋白质，而破坏水化膜需要大量的盐，即盐析作用。相反，胶体金是疏水胶体，几乎不形成水化膜，少量盐就会导致死金，所以我认为，胶体金稳定主要是靠负电斥力（而非水化膜），这也是维持疏水胶体稳定的主要作用力。

5.死金：是指胶体金聚集状态，表现多样，轻者整体变紫，重者变黑并沉淀，还有漂在表面的一层油状物，或悬在液体中的一些不溶物。我们研发时一般都追求稳定的不死金的状态，而死金的状态能够达到更高的灵敏度，所以在某些具体产品上，或者某些公司的整体考量上，也有追求死金的时候，所以你看到别人的产品跑出来深紫色或者黑色的线条，也无需大惊小怪。

胶体金的质量检验

1.肉眼观察：主要评价参数“颜色”，“浑浊与否”，“有没有漂浮的油状物（对于研发来说，如果有少量漂浮物，用枪吸出去就好了，也可以用）”。

2.分光光度计扫描：通常做法是扫描450-650nm的吸收曲线，然后看3个不靠谱的参数，①最大吸收峰位置对应胶体金粒径，颗粒越大，最大吸收峰位置越大；②峰宽对应颗粒均匀度，峰形越细颗粒大小越均匀；③最大吸收峰OD值与相对浓度有关。

这三个参数理论上正确，用起来并不理想，以实际经验说，比如你测BBI的商品化40nm胶体金，他的最大吸收峰在526，半峰宽=42nm，最大吸收值0.94，当你测几组自己烧的金，最大吸收峰位置一样是526，但是可能明显看到这几组金子颜色不一样，电镜结果也显示这几组金子的平均直径分别是30到60nm之间，因为最大吸收峰不光与颗粒大小有关，颗粒的形状也有显著影响，因此最大吸收峰这个参数并不能准确预测颗粒直径。

再说峰宽，如果你测得峰宽都在50、60，那说明你的金子均一性确实比BBI的差很多，那要是你测出来也是42，甚至40，能说明你的均一性好吗？结果是否定的，因为这个峰宽跟峰形有很大关系，有聚集的金子，会导致峰形变化，峰宽会很不确定，有可能变大，也可能变低了。

最后这个最大吸收峰OD值与在这里产生吸收峰的粒子的相对浓度有关，可以考虑用他控制相同工艺下金标复合物的复溶比例，但是没法用他横向比较不同金子。

所以最终你可以扫描出一条有模有样的曲线，但从这个曲线上，你找不到控制金子质量的有效方法，至少以上在文献中出镜率最高的三个参数不行，其他的有待发现。下图是峰形对比，红线为BBI金子，蓝线为自制金子，差异虽然比较明显，但是如何在没有对照的情况下提炼参数，或者加对照设置参数，让质控标准可测量化、数值化？偏离到何种程度，体现到产品性能上完全不能接受？

3.电镜：直观，能看到颗粒形状是否规则，大小是否均一，有无聚集等情况，设备成本高，我没做过，没啥好说的。

4.粒径分析仪：可以看出粒径大小和CV，可以通过PDI判断金子是否聚集，比分光光度计有用，比电镜实惠，但是价格也不便宜。

胶体金的应用

医疗设备展Medtec China2022提醒各位医械制造师，胶体金准备好了，在标记蛋白之前。需要根据检测目标物，来选择一种适用的检测模式，然后再来筛选合适的原料和工艺，而检测什么东西，该用何种检测模式，这需要了解一定的基础原理和具体项目的背景知识。这一话，我们先聊一聊免疫层析的一些概念。

我们先从一个产品名字说起：《人绒毛膜促性腺激素（HCG）检测试剂盒（胶体金免疫层析法）》京械注准20122400225。这个是比较规范的命名方式，其中“人绒毛膜促性腺激素（HCG）”表示待测物，括号里是英文缩写，找原料也经常用英文缩写。

“检测”两个字表示这是一个定性试剂盒，如果是定量试剂盒的话，叫“测定试剂盒”，法规规定正式名称里不能出现定量、快速等字眼，有这些字眼的基本都是历史遗留问题。

“胶体金免疫层析法”是检测的方法学，这个是目前最不统一的地方了，有叫“胶体金法”的，有叫“免疫层析法”的，有叫“干式免疫层析法”的，胶体金还算好的，加上荧光更加乱套，可以叫荧光法、免疫荧光法、免疫荧光层析法、荧光免疫层析法、干式免疫荧光层析法、干式荧光免疫层析法……，再加上时间分辨荧光、量子点等等，叫法很不统一，这还不是最难受的，难受的是当你去国家药监局网站查询同类厂家的时候，会发现方法学这里中文的（）和英文的()搜索出来的结果还不一样，支付宝都扫不到的福，在这服了。

“京械注准”表示北京药监局批准注册的医疗器械产品，二类产品一般都在省局注册，如果是进口的二类是国家级批准的。“2012”是注册年份，后面接的2表示第二类，再后面的40表示这是6840分类（临床检验分析仪器）。再后面的0225是药监局注册的流水号。公司领证值得庆祝，这里留个彩蛋，20120225是我个人领证的喜庆日子。

下面再来说一下什么是胶体金免疫层析法？我们一个一个的名词拆解开来：

胶体金：前面已经说过，他的作用是指示剂/示踪剂，形成肉眼可见的信号，表明这里发生了反应。类似的指示剂可以换成彩色胶乳、荧光微球等。

免疫：内在原理，基于抗原抗体特异性结合的免疫学原理。这个留到下一话讲解。层析：外在形式，利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。在这里，分配比例不同是我们通过免疫结合实现的。

来源：白话胶体金、IVD网