医疗技术展一文综述三种气体灭菌方式对 COP-PFS 包装的蛋白类药物的影响研究
2023-08-23
随着医疗行业的发展，对医疗器械无菌的要求将越来越多。无菌医疗器械时代，医疗器械灭菌包装的重要性不言而喻；构建无菌屏障系统，依赖适宜的灭菌方式和包装，它是一个不可或缺的重要环节。
摘要：
为了降低经眼玻璃体注射感染风险，预灌封注射器 (PFS) 外表面必须进行灭菌，环氧乙烷 (EO) 或汽化过氧化氢 (VHP) 是常见的二种灭菌气体。最近，二氧化氮 (NO2)也被开发为灭菌气体。
众所周知，玻璃PFS的气体透过率近乎为零，相较而言聚合物 PFS (P‑ PFS) 则具有较高的透气性。因此，人们担心外表面灭菌对 P‑PF S包装的药物有潜在影响。
本研究，使用三种气体 EO、VHP 和 NO2 进行P‑PFS外表面灭菌，注射器中分别灌装注射用水 (WFI) 和人血清白蛋白 (HSA) 溶液。
检测灌装 WFI 的 P-PF S渗透进入的三种气体的浓度，分析量化三种灭菌气体对灌装 HSA 的物理和化学降解影响。
经 EO 或 VHP 灭菌的 P-PFS，在 WFI 组检测到进入的 EO 或过氧化氢分子。此外，在HSA组观察到加合 EO 或氧化的 HSA 分子。相比之下，NO2 灭菌的 WFI 组基本检测不到 NO2 进入，HSA 组未检测到蛋白质降解。
引言
经眼玻璃体注射(IVI)的药物主要为抗血管内皮生长因子(VEGF)，如雷珠单抗、阿柏西普。但进行 IVI 有时会引起严重的不良事件如感染性和非感染性眼内炎，可能是由注射器导致，特别是其中的硅油，可能会造成“飞蚊症”。
相比西林瓶包装，使用 PFS 包装 VEGF 进行 IVI 手术，能缩短配药和注射时间，减少眼内气泡和硅油滴，提高剂量控制精准度，降低眼内炎发生风险。
常规 PFS 是玻璃材质并需要硅化，玻璃有潜在的破裂、脱片可能，硅油在长期储存下有可能引起蛋白凝聚，另外硅油本身也会导致一些 IVI 不良反应，因此需要无硅油的包装和注射系统。
近年来，无硅油聚合物 PFS 的出现，解决了上述问题。然而，IVI 用 PFS 外表面需灭菌，以避免在手术操作时造成眼部感染，聚合物的气体透过率要高于玻璃，如果采用气体灭菌，这可能会成为一个问题。
EO 和 VHP 在医疗器械灭菌中被广泛使用，但对于包装蛋白大分子类生物制剂的 P‑PFS，EO 和 VHP 会渗透进注射器内，会导致蛋白降解甚至发生变性。
NO2 灭菌作用机制为脱氧核糖核酸 (DNA) 中的单链断裂，对蛋白大分子无破坏，能最大限度地降低在 PFS 中的敏感药物降解的风险，NO2 还表现出低聚合物渗透性，可以减少进入P‑PFS 的气体量。
NO2 的这些特性可能使其成为 IVI 用 P-PFS 外表面灭菌的合适选择。
本研究的目的是评估采用三种气体对P‑PFS外表面进行灭菌后的结果和影响。PLAJEX P‑PFS分别灌装 WFI 和 HSA (模拟蛋白药物)，灭菌后25°C 下储存0个月和1个月后检测进入 WFI 的灭菌气体含量， 0、1 和 3 个月后评估 HSA 的凝聚和化学降解情况。
材料和方法
P-PFS：泰尔茂 PLAJEX 无硅油 0.5 mL鲁尔旋锁预充注射器，环烯烃聚合物(COP)针筒，丁基/丁二烯橡胶护帽，i-coating 涂层无硅油活塞。
样品制备和储存：WFI 组，HSA 组，对照组灌装量均为 0.165mL，HSA 浓度 0.25mg/mL，储存温度25 ± 2 °C ，湿度40 ± 5%。
灭菌方法：P-PFS 包装在灭菌袋中，EO 灭菌采用 ISO 11135 : 2014 标准，VHP 和 NO2 灭菌满足生物指示剂 (BI) 降低 6-log。
检测项目及方法：
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WFI 组灭菌气体透过浓度检测：GC‑MS
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微粒检测：流动成像分析 (FIA)
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亚微粒子检测：纳米粒子跟踪分析(NTA)
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纳米聚集体分析：沉降速率分析（SV-AUC）
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低聚物评价：十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
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HSA 蛋白降解：通过肽图测量
结果
WFI 组 灭菌气体透过浓度分析：
EO 灭菌后第1天进入的 EO浓度 7.4mg/注射器，储存4 周后降至 1.3mg/注射器。该结果表明，EO 可通过灭菌透入 P‑PFS，随储存时间的增加逐渐分解或扩散出注射器。测得的 EO水平高于EMA可接受限。
相反，VHP 灭菌后的 H2O2 进入量在第1天低于定量限(LOQ)，然而，随着时间推移，H2O2 逐渐增加，在储存4周后测量为 0.03mg/注射器。该结果表明， VHP 灭菌后 H2O2 没有立即完全进入，二级包装中残留的 VHP 会在储存过程中逐渐渗透进 P‑PFS。
NO2 灭菌后第1天，为 0.0054 mg/注射器，接近LOQ，在第4周时低于LOQ。结果表明，NO2 灭菌几乎没有气体透过，残留气体在储存过程中也没有逐渐进入。
HSA组 蛋白质聚集和低聚物分析：
为了评估 P‑PFS 表面灭菌对 P‑PFS 中蛋白质聚集和低聚物形成的影响，使用 FIA、NTA 、SV‑AUC 和 SDS-PAGE 进行分析。
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通过 FIA 测量HSA溶液中的微粒浓度，结果表明在3个月的储存期间，没有一种灭菌方法加速 HSA 溶液中微聚集体的形成。
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通过 NTA 检测HSA溶液中亚微粒的浓度，结果表明，没有一种灭菌方法会造成亚微聚集体的形成。
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通过 SV‑AUC 检测 HSA 溶液中单体、二聚体和寡聚体的百分比，结果表明，在灭菌或储存 3 个月后没有明显变化。
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通过 SDS-PAGE 评价，未灭菌 HSA 和所有灭菌 HSA 溶液的结果基本相同，储存3个月后，HSA 的单体和二聚体条带与储存前观察到的基本相同。
HSA 组 肽图分析蛋白质化学降解：
使用 LC‑MS/MS 分析 P‑PFS 灭菌和储存后 HSA 的蛋白质化学降解。结果表明，VHP 和 EO 灭菌在灭菌后或储存 3 个月后立即对 HSA 进行了化学修饰，而 NO2 灭菌不会引起硝化，并且氧化率低于 VHP 灭菌，即使在灭菌后3个月后也是如此。
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讨论
VEGF 抗体类药物通过 IVI 大大改善了各种视网膜疾病的治疗，目前常规包装是玻璃 PFS，但玻璃注射器需硅化润滑，在 IVI 手术时硅油会进入玻璃体，可能导致“飞蚊症”。
此外，蛋白质/硅油液滴复合物和硅油诱导的蛋白质颗粒的形成可能导致免疫反应或炎症。因此，无硅油 PFS 成为更适合的选择。
作为不含硅油的聚合物 P‑PFS，带有 i 涂层活塞的 PLAJEX PFS 可以解决许多与硅油相关的问题。然而，与玻璃相比，聚合物的透气性更高，可能会对药物产生负面影响，因为在外表面灭菌过程中可能会进入气体，而这又是 IVI 中使用的 PFS 所必需的。
在目前的研究中， EO 灭菌中的 EO 可通过 P‑PFS 渗透进入溶液，而 VHP 灭菌中 H2O2 的进入相对较低，NO2 灭菌中几乎没有观察到 NO2 进入。
气体渗透是一种传质过程，气体分子通过聚合物层的扩散过程从外部环境转移到内部环境。外包环境中的气体分子在聚合物表面的吸附结合，分子在气体浓度梯度的驱动下扩散透过聚合物层，并从材料的内表面扩散。影响气体渗透的主要因素是聚合物特性，例如聚合物结构、自由体积和孔隙率，与玻璃注射器相比，这些特性导致 P‑PFS 具有更高的气体渗透性。
在 P‑PFS 的外部灭菌过程中影响气体进入的其他重要因素包括加热温度、灭菌气体浓度和灭菌气体的性质。外表面灭菌过程中的高温可能会增强灭菌气体的吸附和扩散。EO 灭菌通常需要在 40–60°C 的范围内加热才能达到微生物杀伤力。
相比之下，VHP 和 NO2 灭菌不需要加热，该过程可以在室温下进行。此外，灭菌剂气体浓度之间的差异也可能影响气体渗透，因为扩散是由外部和内部环境之间的气体浓度梯度驱动的。EO 灭菌需要比 VHP 和 NO2 灭菌更高的气体浓度。
与 VHP 灭菌期间的低气体进入和 NO2 灭菌期间没有气体进入相比，灭菌温度和灭菌气体浓度的这些差异可能导致当前研究中 EO 灭菌期间气体进入相对较高。
总的来说，为了最大限度地减少灭菌剂气体进入，重要的是根据经验测试不同的气体灭菌程序并选择气体进入量最低的程序。
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PLAJEX 注射器，采用NO2 进行外部灭菌，没有灭菌气体进入。因此，使用此 P‑PFS 和此外部灭菌程序可以降低 IVI 蛋白药物受损的风险。
我们对不同灭菌方法对 HSA 造成的潜在损害的分析结果支持了这一结论。
首先，评估了由外表面灭菌引起的蛋白质聚集和低聚物。化学降解会促进某些蛋白质的蛋白质聚集。例如，EO的内加等变性或VHP 氧化可能会促进蛋白质聚集。然而，在我们的研究中，未灭菌和灭菌 P‑PFS 的 HSA 样品之间未显著地观察到蛋白质颗粒和聚集体水平的差异。
同样，在我们之前关于 P‑PFS 中残留 EO 气体对蛋白质化学修饰的影响的研究中，没有观察到 EO 加合的蛋白质聚集。
灭菌气体引起的预期蛋白质修饰是通过将 HSA 溶液直接暴露于每种灭菌气体，分析化学降解来验证。接触 EO 诱导 Cys34 和 Met329 的EO加合物，VHP 暴露导致磺酸氧化 Met329 和氧化 Cys34。 NO2 暴露导致氧化损伤低于 VHP 灭菌，硝化量相对较低。
这些对不同灭菌气体的反应性差异也可能是选择外表面灭菌方法时要考虑的重要因素，这样可以最大限度地减少 P‑PFS 中蛋白质的潜在化学降解。
正如预期的那样，我们发现 HSA 中的这些氨基酸残基在注射器溶液中被氧化或导致 EO 加合物，该溶液使用 VHP 或 EO 通过外部灭菌方法处理。
医疗技术展发现，治疗性蛋白质的化学修饰有可能对患者造成不良影响，氧化会导致治疗性蛋白质引起的不良免疫原性，医疗包装上的 VHP 残留物会引起氧化并影响产品的长期稳定性、安全性和有效性。不改变 P-PFS 中蛋白质的外部灭菌方式，对于防止这种潜在的不良反应非常重要。
结论
用 EO、VHP 和 NO2 气体对 P‑PFS 的表面进行外部灭菌，以评估对 HSA 溶液的影响。由于相对较高气体浓度和 EO 与蛋白质残留物的高反应性，EO 灭菌导致 EO加合到蛋白质上。VHP 则通过灭菌气体透过导致氧化发生。
NO2 灭菌没有发生可检测到的气体透过，因此对 HSA 没有可观察到的聚集或化学降解。除了这种特性外，NO2 灭菌还可以在室温和低真空下进行，从而最大限度地降低 P‑PFS 中灌装药物热降解的风险，以及在活塞滑动时进入。
因此，二氧化氮(NO2 )是包装IVI用蛋白类制剂的P‑PFS外表面灭菌的合适方式。
文章来源：小包服
